许建阳1 王发强1王梅康1刘庆安1宋开源2 杨介宾2
 (1、武警总医院 北京 100039  2、成都中医药大学 )

摘 要：目的 为了系统比较不同时辰、不同机体状态，在镇痛方面的不同作用，并阐述其作用机制。方法 实验在“阳虚”、“阴虚”模型的基础上，进行截肢术造成创伤痛模型，电针“太溪”和“足三里”，以免疫组化的方法检测Fos蛋白的表达。结果 不同时辰电子表针对“阳虚”、“阴虚”大鼠创伤痛有一定的治疗作用和镇痛效应。电针可使其痛阈提高，电针可抑制创伤痛诱导的下丘脑Fos蛋白的表达。其具有明显的昼夜节律性。基本探明“阳虚”大鼠电针镇痛的最时机在卯时；“阴虚”的则在酉子时，两者呈相互对应性。结论 择时针刺治疗痛证，具有增强镇痛效应，为临床提供了重要的参考依据，具有一定的理论和实际意义。

关键词：电针/针刺镇痛 创伤痛/痛阈 下丘脑 基因表达/Fos蛋白  昼夜节律/单个余弦法

肇始于五十年代末的针刺镇痛原理研究，经过国内外学者大量临床和基础方面的研究，已获得了丰富的针刺镇痛知识，而且取得了许多令人瞩目的成果（1）。针刺镇痛效应，是由多种因素决定的（2）。其中机体状态和时间因素是非常重要而值得进一步探讨的问题。因针刺镇痛调整作用是以机体生理机能、病理变化为基础，而机体有着自身固有的生理、生化等节律。近年来随着时间生物学的发展，掀起了对生物节律研究高潮,目前对时间针法的研究做了大量的工作，至今尚无突破性进展。随着分子生物学的迅猛发展,开创了现代生物学的新时代。 基因表达与疾病发生的关系是医学分子生物学研究的核心。原癌基因c-fos属于在缺乏蛋白合成条件下，其mRNA能被诱导的基因，由于刺激后的快速一过性表达，其的显示不仅可用于明确伤害性反应神经元，同时，也适于检验多种因素调节伤害性反应通路活性的神经机制。对于c-fos的研究做了一些工作，但对不同时空、不同机体状态下同一细胞和同一机体状态下不同细胞c-fos的表达是否相同，这一问题值得进一步研究，对揭示针刺镇痛的本质有重要而深远的意义。
1.不同时辰电针前后对“阳虚”、“阴虚”大鼠痛阈的影响
1.1.材料与方法
1.1.1. 动物选择：
    选用健康SD成年大鼠150只中筛选出96只，体重200±20g，雄性，全价颗粒饲料均由四川省输血研所实验动物中心提供。动物在实验前驯养1周，并进行筛选，其标准是：以辐射热灯照射左后足热部，测定在5秒(s)左右能引起缩腿反应者用于实验，而少于2s大于10s者表示动物反应过敏或迟钝，则弃之不用。在光照时12∶12(黑暗期为19∶00—7∶00，光照期为7 ∶00—19∶00)条件下驯养2周，自由饮水，取食。
1.1.2分组及处理
    实验开始时，将动物随机分为以下3组，并分别予以相应处理。
A.正常对照组：8只/时辰，不造模。于实验前与造模组同样方法固定20min。
B.阳虚组：8只/时辰，造模与醋酸氢化可的松注射液(江苏扬州制药厂，批号9604291)，肌肉注射，用量，20mg/kg bw/d,用药10天，停药10天后电针20min。
C.阴虚组：8只/时辰，造模，促肾上腺皮质激素(ACTH)(上海生物化学制药厂，批号：9605319) 腹腔注射，用量，16微克/kg bw/d，用药4天后电针20min。
1.1.3电针方法：
    先将大鼠用鼠夹固定，选取左后肢的“太溪”、“足三里”取穴依据《兽医针灸学 》（4），并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位。(太溪足少阴肾经之原、俞穴配以足阳明胃经多气多血之经的合穴足三里，二穴相配，阴阳上下，共同达到镇痛作用)，用0.5寸毫针，直刺0.3 —0.5cm，连接WQ—10C型多用电子穴位测定治疗仪，选用疏密波型，频率20—100Hz交替， 电压2—4V，波宽：0.2—0.6ms，电针时间：20min。
1.1.4指标检测方法
1.1.4.1痛阈的测定
    在大鼠左后足掌心处固定点，用自制弹簧棒测定。测定时，让动物保持安静，测试者将弹簧棒均匀下压，直至动物发生缩腿反应，共测3次，每次间隔5分钟，取其均值。
1.1.4.2实验数据的统计方法
    实验数据采用多个样本均数比较，方差分析，q检验(Newman-Keuls法)，t检验及t'检验处理和单个余弦法处理。

1.2.结果与分析
1.1不同时辰电针对“阳虚”、“阴虚”大鼠创伤痛针刺前后痛阈的影响(X±SD) 
组别           子                 卯                午                酉
A           （n=8）            （n=8）           （n=8）           （n=8）                      
针前      9.625±2.29        8.750±1.60       7.417±2.71       7.625±2.64
针后      9.083±2.49        9.417±1.16       6.083±2.11       9.625±2.64* 
B                                                                   
针前   10.50±2.45    8.469±1.58   10.563±1.57    9.938±1.12
针后   11.719±3.45  13.219±2.56△△** 6.938±1.49*   9.063±2.71
C                                                                  
针前   3.531±0.70●●△△4.063±2.42●●△△ 3.281±1.11●●2.594±0.59
针后   7.563±1.29● 7.031±1.09●●△8.231±1.76  8.094±0.94**
注：与针前组比*P<0.05 ，**P<0.01与A组比△P<0.05 ，△△<0.01
与B组比●P<0.05 ，●●P<0.012
    从表1.1得出，A组、B组和C组在针刺前后痛阈有不同的昼夜节律变化。针前 ：A组痛阈值波动不大，子卯较高、午酉较低；B组痛阈值较A组高，其中午时最高；C组痛阈 值较A组低，其中卯时最高(P<0 .01)；针后：A组痛阈增加(除午时外)，其中酉时较针前有显著性差异(P<0.05)，具有昼夜节律性 ；B组针后痛阈明显升高(除午时外)，其中午时(P<0.05)和卯时(P<0.01)有统计学意义，C 组痛阈明显升高，具有昼夜节律性，其中午时(P<0.05)和酉时(P<0.01)有显著性差异。
“阳虚”组与“阴虚”组比较，“阳虚”组针后痛阈最高在卯时，“阴虚”组痛阈最高在酉时，两组相比针效正好呈180°，提示“阳虚”组在卯时针刺效果最佳；“阴虚”组在酉时针刺疗效最宏。

2.不同时辰电针抑制“阳虚”、“阴虚”大鼠创伤痛诱导的下丘脑Fos蛋白表达的影响
2.1.材料与方法
2.1.1 动物选择
    选用健康SD成年大鼠 224只，其余同实验1
2.1.2分组及处理
    实验开始时将动物随机分为7组，按四个时辰(子、卯、午、酉)分别处理。
A正常对照组：8只/时辰，不造模，于实验前与电针同样方法固定，20min。
B正常+创伤截肢组：8只/时辰，于实验前30min在大鼠左后足踝关节下0.5cm行截肢术，压迫止血。与电针组同样方法固定 20min。
C正常+截肢+电针组 8只/时辰。
D阳虚+截肢组：8只/时辰。
E阳虚+截肢+电针组：8只时辰。
F阴虚+截肢组：8只/时辰。
G阴虚+截肢+电针组：8只/时辰。
2.1.3主要试剂：
免抗c-fos抗体，(购自北京中山生物技术有限公司，为SANTA(RU2产品)ABC试剂盒(含DAB染色剂,为华美生物工程公司产品)其它试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.4灌注取材及切片
    用0.3％戊巴比妥钠以30mg/kg剂量麻醉大鼠。麻醉后将大鼠仰卧放置，开胸经左心室进行主动脉插管，剪开右心耳，首先迅速灌注100ml灭菌生理盐水，然后灌注250ml，4℃ 4％多聚甲醛(PFA)固定液，灌注后取大鼠脑 ，在同一固定液中后固定6-12h，然后浸入20 ％蔗糖PBS液中直至组织块下沉。在恒冷箱切片机(-17—-22℃)内做脑，连续切片（按照Paxinos和Watson的鼠脑图谱（3），选取所需的断面），片厚20μm，切片下后再入上述固定液中固定4-6h备用。
2.1.5指标检测方法
2.1.5.1 c-fos检测法(免疫组织化学ABC法)
切片入0.01mol/L PBS (pH7.4)中洗10min×3次；0.3％tritonx-100中30min；0.3％ H202 -PBS液中15min；0.01mol/L PBS中洗10min×3次；入正常羊血清PBS液中孵育20min；进兔抗C-fos 抗体中孵育；0.01mol/L PBS说10min×3次；入生物素标记羊抗兔IgG中 孵育；0.01mol/L PBS 洗10min×3次，入ABC复合物中孵育；0.01mol/L PBS洗10min×3次 ；DAB染色；双蒸水终止染色，用铬明胶将切片贴于载玻片上，过液凉干；梯度酒精脱水； 二甲苯透明；中性树胶封片。
2.1.5.2 免疫组化对照试验
2.1.5.3非特异性对照
   用正常羊血清代替c-fos 抗体，其它步骤与免疫组化ABC法程序相同。
2.1.5.4 阴性对照
   用PBS代替c-fos 抗体，其它步骤与免疫化ABC法程序相同。
2.1.5.5 Fos 样免疫反应性(FLI)的性细胞计算方法，
在每一动物的组织切片中随机抽样4张，每张切片选下丘脑区域的左上、右上，左下，右下和中央部五个视场进行阳性细胞计数取平均值。其图像处理均在四川联大计算机图像处理中心进行处理。
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2.2结果与分析
表2.1不同时辰电针各组大鼠下丘脑FLI的影响(X±SD) 
 组别      子(n=8)       卯(n=8)       午(n=8)          酉(n=8)            总体  
   A     2.13±0.64     4.13±2.75     3.50±0.93       2.75±1.17         3.13+1.69
   B    22.75±3.58    22.00±2.45    28.63±3.38●●    23.15±2.10☆☆      24.13±3,87
   C    24.25±2.12    19.75±1.04△△  13.25±2.31●●○○    17.38±3.20●●○○        18.66±4.59
   D    22.75±2.66    24.63±2.56    43.25±4.71      28.75±5.85△☆☆  9.84±9.08
   E    22.25±5.73    14.38±2.32△△○  30.25±2.76●●○     ○31.38±3.02●●     24.56±7.80
   F    31.88±7.28    37.13±3.39△      27.50±2.20●○         29.00±4.21●●           31.38±5.79
   G    26.00±3.55○      24.25±3.28○○  24.63±2.88●●○       19.88±3.27●☆○○       23.81±3.95
从表2.1得出，A组其表达很少，子时最低，卯时最高，造模组： B组午时最高，卯时最低；D组，午时最高，子时最低；F组卯时最高，午时最低，针刺组：C 组午时降低最甚(P<0.01)；E组卯时降低为甚(P<0.01)；G组酉时降低为甚(P<0.01)。“阳虚”、“阴虚”组针前后，存在相对立的关系。“阳虚”组其最佳降低下丘脑FLI的时辰是卯时，“阴虚”组其最佳时辰是酉时。与痛阈吻合。
表2.2不同时辰电针各组下丘脑FLI余弦法节律参数
组别  测数    PR       P      F     中值±SE       振幅(95％CL)       峰相位(95％ CL)
  A       32     16.899      0.0682    2.948      3.125±0.57            0.972 (N。S)             -119.999(N。S)
  B       32      30.879     0.004     6.477     24.125±1.20       2.990 (0.847 ，5.134 )    -175.840(-221.625，-130.056)
  C       32      77.311     0.001    49.410     18.656 ±0.81      5. 626 (4.166 ，7.086)   -177.183(-192.223，-162.143)
  D       32      68.933     0.001    32.174     29.687 ±1.82     10.149 (6.885 ，13.412 )  -176.725(-195.484，-157.965)
  E       32      70.284     0.001    34.295     24.249 ±1.54      8. 832 (6.081 ，11.533 ) -228.072(-246.220，-209.923)
  F       32      34.147     0.002     7.519     31.375±1.72       4.614  (1.545 ，7.683 )   -46.699 (-88.395 ，-4.999)
  G       32      18.690     0.049     3.333     23.812 ±1.33       2.379 (0.00964，4.757 )   -51.801 (-324.192，-139.489)
360度=24小时，相位参考∶0000=度
从表2.2：A组无昼夜节律，振幅0.92， 峰相位在7∶00左右；造模组：B组有昼夜节律，振幅升高2.9，峰相位在8∶00—14∶00之间；D组有昼夜节律，振幅10，峰相位在10∶00-13∶00之间；F组有昼夜节律，振幅4.6， 峰相位在0∶00—5∶00与B、D组比有差异(P<0.05)。针刺组：C组有节律性，峰相位在10∶ 00—12∶00之间；E组有节律性，峰相位在13∶00—16∶00与C组有差异(P<0.05)；G组有节律性，峰相位在9∶00—21∶00之间与F组有差异(P<0.05)。
“阳虚”组和“阴虚”组比较，造模时两者峰相位有差异(P<0.05)，“阳虚”组其峰相位 在午时左右，“阴虚”组其峰相在子时左右，针刺后两者无明显差异，提示“阳虚”和“阴 虚”创伤痛在下丘脑FLI表达存在相互对立的关系。

3. 讨   论
针刺的镇痛效应及其中枢的重要物质基础已经研究得比较清楚，针刺镇痛的昼夜波动性亦做了一些工作，但在不同机体的病理状态下针刺镇痛的昼夜波动性尚未见报导。本研究以中医疼痛理论为指导，借助免疫组织化学等先进检测技术为手段，深入探讨针刺镇痛对体质和时间作用的机理。使时间针法的研究推向一个新的水平。
3.1 电针对“阳虚”、“阴虚”大鼠的镇痛效应
痛阈是目前被广泛采用以判断镇痛效果的指标。痛阈的高低与刺激强度及其作用时间成正相关，即引起痛反应所用的刺激强度越大，作用的时间越长，则表明痛阈越高，针刺后痛阈升高得越多，表明镇痛效果越好，反之越差。
本研究发现“阳虚”组动物基础痛阈较正常空白对照组高；“阴虚”组动物其基础痛阈较正常空白对照组低。针后“阳虚”、“阴虚 ”组大鼠痛阈均有不同程度的升高，并呈现昼夜节律变化。其中“阳虚”组在卯时升高为甚，“ 阴虚”在酉时升高为甚。说明电针可改善“阳虚”、“阴虚”大鼠的疼痛状态，这与许多学者的报道一致（6）。这种确定的镇痛效应为本研究镇痛机制的比较提供了先决条件。
3.2 电针抑制“阳虚”、“阴虚”大鼠创伤痛诱导下丘脑Fos蛋白表达的机制探讨
Hunt首次（7）证明了c-fos与疼痛关系。研究表明慢性炎症性疼痛与其它急性体感性伤害性刺激诱导的脊髓Fos表达的时程明显不同，随着伤害性刺激强度或持续时间的增加，可导致Fos表达模式的改变，包括FLI(Fos-like immunoreactivity )阳性神经元总数增多，染色加深，分布区域扩大等；进一步表明同一刺激的不同强度或持续时间亦有Fos表达的特定模式。各种伤害性刺激不仅诱导c-fos在脊髓和大脑内表达，并见其有不同的时间过程和区域分布。许氏发现电针抑制Freund氏完全佐剂诱导的大鼠海马中的表达（8）。有人（9）发现电针“夹背穴”抑制创伤痛可诱发的脊髓Fos蛋白表达。
本研究发现电针后其下丘脑 Fos的表达均有不同程度的抑制，提高镇痛效果，并呈昼夜节律性。根据前人成果并结合本研究结果，电针抑制创伤痛诱导的下丘脑 Fos 的表达。其作用途径可能有如下几种情况：1.电针促进c-fos蛋白的自调节，使其表达受到抑制；2.电针直接抑制创伤痛诱导的c-fos表达并且使其阿片肽表达增强；3.阿片肽增加后又抑制c-fos 的表达；4.电针可能激动这种环路而发挥作用。
3.3 电针对创伤痛镇痛时辰的机理探讨
择时针刺镇痛对痛阈，脑内单胺类神经递质以及cAMP/cGMP等的周期性变化已有一些文献报道（10）。但针刺对不同机体状态，不同时辰的镇痛效应研究甚少，以原癌基因c-fos 表达为指标择时镇痛的研究未见报道。前两者称为第一、二信使，后者称为第三信使。根据本实验结果表明，在正常组针前痛阈最高在子时，最低在午时；针后，痛阈最高在酉时，最低在午时，其实验结果与前人（11）等研究结果有相同的趋势。“阳虚”组针前午时最高，卯时最低，针后卯时最高，午时最低。其中正常组与“阳虚”组午时针后痛阈不仅没有升高反而降低。“阴虚”组针前卯时最高，酉时最低，针后酉时最高，卯时最低，正好与“阳虚”组针前后恰恰相反。从而说明“阳虚”、“阴虚”在时辰与针刺镇痛效应正好相差180°，存在着对应性，进一步证实中医阴阳学说理论。
关于第三信使c-fos 的昼夜节律变化。本实验研究表明 ：下丘脑c-fos 的表达“阳虚”、“阴虚”组存在着相互对应关系，并具有昼夜节律性。“阳虚”组最佳电针抑制其表达的时辰为卯午时，“阴虚”组电针抑制其表达的最佳时辰在酉子时。
    根据前人研究（12）及本实验研究结果，对针刺镇痛效应的时间生物学产生的机制提出如下认识：在不同的时间内运用相同的针刺手法针刺同一(组)穴位，之所以有时产生相同的针刺效应，有时则产生明显不同的针刺效应，这是由不同时间内机体的机能状态是否在相同或不同的水平所决定的。如果在不同时间内机体的机能状态处在相同或相近的水平，则不同时间内的针刺效应往往无明显差异；若在不同时间内机体的机能状态处在明显不同的水平，则不同时间内的针刺应往往就会出现明显差异。
针灸时间治疗学即子午流注针法，是以时间为条件选取穴位进行针刺治疗的方法。它是根据“人与天地相参”的理论而来的，人体气血流注于经脉之中，随着时间变化而有周期性盛衰变化规律，而十二经脉的原穴、五输穴及八脉交会穴，也有周期性的开阖变化规律，根据这种盛衰开阖的规律选取腧穴进行针刺治疗就可取得良好效果。现代时间生物医学,是研究生命运动随时间变化规律的一门新兴学科。以明尼苏达大学哈尔贝格(Franz Halberg)为首的各国科学家展开了多方面的研究,这些研究都注重探索人体各种生理、病理节律，现代时间生物学的进步,为古老中医基础理论提供了科学证据和先进的研究手段，是中医时间医学科学内核在更高阶段的发展；而中医千百年来创立的理论和积累的宝贵经验，对于现代时间生物学的发展，无疑会起到积极的推动作用。现代时间医学和中医学两者在对生命基本特征之一—生命节律性的认识上，找到了共同的基本点。我们认为,这是十分可贵的一步。通过本研究以期对中医时间针灸学有所裨益。

4．参考文献
1． 陈汉平，等.  影响针灸效应的研究院.  上海针灸杂志，1990；（1）：1
2．中国畜牧兽医学会主编 .  中国兽医针灸学.  农业出版社.1984
3．Paxinos.G and Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. 1989;Sydney
4．黄  泳，等. 不同时辰电针“足三里”对佐剂关节炎家兔痛阈单胺类介质及组胺影响的实验研究. 中国中医药科技，1995；（1）：9
5．陈小野. 实用中医证候动物模型学. 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993
6．娄之聪，等. 创伤痛诱发大鼠束旁核Fos样蛋白表达.  针刺研究，1994；（3-4）：56
7． Hunt S P. Piria. Evans G.Induction of c-fos like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation. Nature.1987;(328):632
8． 许建阳，等. 电针对实验性风湿关节炎大鼠海马中c-fos表达的影响.中国针灸，1998；（1）：47
9． 宋开源，等. 时间针灸学研究进展.上海针灸杂志，1989；（2）：22
10．邱学才，等. 大鼠脑室注射cAMP/cGMP对电针镇痛的影响.  中华医学杂志，1981；（40：225
11．童  健，等.cAMP的昼夜节律与细胞生物种.  时间医学杂志，1996；1（2）：5
12．陈少宗.  针刺效应与时间相关规律，  时间医学杂志，1996；1（2）：3

作者简历：
许建阳，1962年11月生，男，汉族，河南济源人。医学博士后，现任武警总医院中西医结合科主任、教授、主任医师、博士生导师、兼任解放军军事医学科学院、北京中医药大学等院校研究生导师。从事针灸、中西医结合专业。
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